邢唷��>� 69���5������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������欹�] ��<$bjbj簞簞 .&仡!b仡!b �R�������xx� ����2228j$�$2�t��(������)++++++$6��€O-�����O���|111����)1�)111�����0驓�=嵊�����1�0�1l ��l 1l 1���1�����OO�����������������������������������������������������������������������������l ���������xB �: Yeast Protein Isolation All reagents should be at 4(C and samples handled on ice until 2min spin Spin down 1-1.5x107 log-phase cells in a 2ml tube, wash cells with 1 ml water You can freeze the cell pellet in N2 and process later This can be scaled up 5x � increase the volume of all the reagents by 5x except the acetone, do two washes with 1ml of acetone* *for low cell number process samples straight after MEP Rapid Aging Purification, include 1x cOmplete Protease Inhibitors in buffers during MEP purification Re-suspend cell pellet in 100(l water Add 15(l 2N NaOH w/ 80mM DTT (freshly added), vortex, ice for 10 minutes Add 15(l 50% TCA, vortex, ice for 10 minutes Samples can be held indefinitely at 4( at this point Spin 2min 14,000rpm at RT Pipette off supernatant into TCA waste, add 1ml ice-cold acetone Invert to mix then spin 2min 14,000rpm at RT Pipette off acetone and dry briefly For normal samples Re-suspend pellet in 40(l sample buffer, vortex and heat at 65( for 5 min Vortex again until pellet is gone (pipetting can help too) Heat 5 min at 65( again For low cell number Resuspend in 20(l of Laemlli buffer containing freshly added 100mM DTT Heat 5 mins at 95癈 Spin the sample for 30s at top speed and transfer supernatant to new tube, store -20( Quantification and loading: Measure concentration by OD280. Use buffer including DTT as a reference since DTT absorbs at this wavelength Add 10x Orange G to each sample to 1x final concentration before loading For samples in Sample buffer: Heat 10min at 65(, spin briefly and load on gel (Don抰 place samples on ice as they will solidify!) For samples in Laemlli buffer: Heat 5min at 95(, spin briefly and load on gel Sample buffer: 10ml�: 70mM Tris pH6.8 700祃 of 1M 8M urea 4.8g 5% SDS 2.5ml 20% (the good stuff from Biorad) 1mM EDTA 20祃 of 0.5M water to 9ml, warm gently to dissolve 100mM DTT Add from 1M stock just before use Laemlli buffer: 60mM Tris pH 6.8 10% Glycerol 2% SDS (from the high quality 20% stock) Make this to 90% final volume, then just before use add 10% 1M DTT (giving final concentration of 100mM DTT) 10x Orange G: 0.1% Orange G in water  7.4% �-mercaptoethanol can be used, but the process needs to be performed in the fume hood  don t heat samples above 70( in this buffer as the proteins will aggregate  Diluting and measuring by Bradford assay is probably more accurate      FILENAME 45acmuv������h i j l  � � �     & ' 6 7 B E F L M ] e f g � � � � � � 蜾嘬哲嘌腿睦募芳超敞牗湪湪监茑监曕晳崏�戃戃鄷嘬鄳jh襩�0JUh猆oh�>ThT[t jm�h鞾�h��hV hV >*hV hV hV hii� h�'{H*h�'{h=�hKrj h�0H*h�0h齦� j梆h�>-h�>-h鞾�h鞾�h�{5丆J(\乤J(h鞾�h鞾�5丆J(\乤J(2bc���j k  / 0 z { � � � � � ; < j k � �������������������������gd鞾�gdV 勑^勑gdii�gd�'{gdKrj$a$gd鞾�� � � � � � * 3 < I j k � � � � � � � � � � � � � � � � � � : ; B C D V W Y g h � � � � � � � � � � � � 耥耥殄磲眈眈蓠僬碚硌袷祈倏俚倏俦侏辟保睙贌俦俦棻頁褜� j梆hV!�hii�h/�OJQJh谼� jm�h/� h��h/�h/�jh��0JU j梆h��h�!= jm�h鞾�hV!�he�h��h�>Th�([h襩�h=�h�>-h鞾�hT[t j梆hT[t7� � � � * B C X � � � ) * � � � � 3gh����������������������������gdV gd/�gdii�勑`勑gd��gd��gd鞾� ) H I � � � � � � 123fgh����������/0��������F疰疴疴疝怵尊掴摒逾题募宝紴棑彄鹩饒~zrz驸题h襩�OJQJh襩�jh襩�0JU hVEhV!�he�hii� hVEhii�hii�mH sH he�he�mH sH he�h�!=mH sH h�>-mH sH h��mH sH  j梆h��hV j梆hV!�h/�h��jh��0JUhV!�hV!�hV!�6�ha�,�����0Jv����O������F�������������������������������gd��gd鞾� 劆勑^劆`勑gdii�gdV FH�����������$$$$$'$+$,$-$.$/$5$6$7$8$9$:$;$<$躐礤礤礤礤磔僮菸蓠偈倨偌都倨頄 hVEhV!�jh�P0JU�*h谼�0JmHnHu�* h�P0Jjh�P0JUhdB�h�"�hZGLmHnHuUh�Pjh�PUjhIJ�UhIJ�h��jh��0JU ������,$-$9$:$;$<$�����������gd鞾� Yeast Protein Isolation v1.7 Houseley lab  PAGE 2 ,1恏皞. 捌A!�"�#悹$悹%�澳澳 惸�s2���� 0@P`p€�����2(�� 0@P`p€����� 0@P`p€����� 0@P`p€����� 0@P`p€����� 0@P`p€����� 0@P`p€�8X�V~�����€�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@_HmH nH sH tH @`�@ NormalCJ_HaJmH sH tH DA`��D Default Paragraph FontRi��R  Table Normal�4� l4�a� (k ��(No List 4@�4 �PHeader  �9r 4 @4 �PFooter  �9r .)@�. �P Page Number>@"> ii� Footnote TextCJaJ<���1<� ii�Footnote Text Char@&`�A@ ii�Footnote ReferenceH*PK!檗�[Content_Types].xml瑧薔�0E鱄鼉�-J湶@%閭菐洽|廊�$韶钵UL襎B� l,�3鳛;鉹�得槣B+$�G]ミ7O侪V墎�c:菜�E3v@釶莮�憇� |煓w�<�<爔k猴ll5� 玈Z埣2O,辜帣Q績� €‰壪�5y�;y=卐E颎翼帊|\P疼 鞭M7�$|n]�枌蓢]4忥`窾6涀G冼(垲�^斗菹颻琖� �-翻関]m蓿瓄�  飍祡缧暺}攙旯缦r�鍧 竔倲崜0�� D3劂梋閐�3譙钐嚟�耳杧:忲�8}d-楀鉯*壵x上轻qCよZ}�柣WlшqyI@赹剟6橧!Q_� ﹪s殔刏賩a汛癶H魉Tm�jyV`垆纅�榾惫�<箣犇鼁YpL8�*аx 侏S&机;EUC�8⒊eE�<В悟hg贇!燴H睩x0� VM螽憆刳u�6拺覦s�3 U慮赢b� �6�怂5y嵳2臓iz嘜]r汯璠�'鋆炃弦u涎4j j採� K臀F娃盶�晕�$4寨-莓�-�珠`餜�熘��&藑代觥瀈A<吼"xNW﹦� � 袬鞩R賭[鋺萵 8r� i箯K~� *~P(5黕莲z胦W m忒杮~乖鞹濦caT鲇�.}x E僮5抉&Z緄�2bQ懇/,EE\}�)W�乹埼鉠ミ�6;礏弛�糿h礜 贻~7�威�9R`痌 糧疩〞儬嗾J拁▄旿郢�=$燮朗Sb酻紇���PK! 褠煻'theme/theme/_rels/themeManager.xml.rels剰M �0匃倃oo雍�&輬协�勪5 6?$Q祉 �,.嘺緳i粭澤c2�1h�:闀q毩m胳嶡RN壻;d癭値o7�g慘(M&$R(.1榬'J摐袏T鶂�8V�"&A然蠬鱱}狇�|�$絙{�朠�除8塯/]As賲(⑵锑#洩L蔥汉倪��PK-!檗�[Content_Types].xmlPK-!ブх�6 0_rels/.relsPK-!ky���theme/theme/themeManager.xmlPK-!稝��theme/theme/theme1.xmlPK-! 褠煻'� theme/theme/_rels/themeManager.xml.relsPK]� L�HJ ]���J -&���� DDQQQT� F<$ � ��<$  /ELNT�晙!�晙�8�@����€€€�饞��0�( � �養 �S ���� ?�<@Xanu����w~����(.��   � � � � � �   H K i������HIOO�����1fg�������  � � � � �  9 ; < F K i������HIOO�����1fg�������K 3�2�-UV p#}sVE�>-�0�!=�@�/GgJ蘿JZGL�PjS�>T�([�gKrj猆oT[t�{�'{S~e�蚙�!o�/�鞾�卂�谼�朜�[�7�t� �dB�齦�K�V!�ii�=�a�襩���8�}>�5 �IJ��"� �@€����(  J h@hhH@��Unknown������������G��*郈x� �Times New Roman5�€Symbol3.��*郈x� �ArialC.,�爗 @�Calibri Light7.����@�CalibriA���$B�Cambria Math"1�鹦hL�� eGR|鼏 KX�X�q����亖4  2�� ��HP �?���������������������� �2!xx�蝹d^ ���Yeast Protein IsolationHouseley Jon Houseley�鄥燆鵒h珣+'迟0��������  8 D P \hpx€�Yeast Protein Isolation HouseleyNormalJon Houseley11Microsoft Office Word@�5z @敾~M惶@淂滴@毪=嵊X��胀諟.摋+,0 hp���� ���� � ��Edinburgh Univeristy  Yeast Protein Isolation Title ��� !"#$���&'()*+,���./01234������78������;�����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������Root Entry�������� �F ⒉=嵊:@1Table������������l WordDocument ��������.&SummaryInformation(����%DocumentSummaryInformation8������������-MsoDataStore��������@�=嵊0驓�=嵊S������R��0�RU��YI�0��==2��������@�=嵊0驓�=嵊Item ��������2Properties������������UCompObj���� r��������������������������� ��� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� � ���� �F Microsoft Word 97-2003 Document MSWordDocWord.Document.8�9瞦