邢唷��>� 69���5������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������欹�] ��<$bjbj簞簞 .&仡!b仡!b �R�������xx�
����2228j$�$2�t��(������)++++++$6��€O-�����O���|111����)1�)111�����0驓�=嵊�����1�0�1l ��l 1l 1���1�����OO�����������������������������������������������������������������������������l ���������xB�: Yeast Protein Isolation
All reagents should be at 4(C and samples handled on ice until 2min spin
Spin down 1-1.5x107 log-phase cells in a 2ml tube, wash cells with 1 ml water
You can freeze the cell pellet in N2 and process later
This can be scaled up 5x � increase the volume of all the reagents by 5x except the acetone, do two washes with 1ml of acetone*
*for low cell number process samples straight after MEP Rapid Aging Purification, include 1x cOmplete Protease Inhibitors in buffers during MEP purification
Re-suspend cell pellet in 100(l water
Add 15(l 2N NaOH w/ 80mM DTT (freshly added), vortex, ice for 10 minutes
Add 15(l 50% TCA, vortex, ice for 10 minutes
Samples can be held indefinitely at 4( at this point
Spin 2min 14,000rpm at RT
Pipette off supernatant into TCA waste, add 1ml ice-cold acetone
Invert to mix then spin 2min 14,000rpm at RT
Pipette off acetone and dry briefly
For normal samples
Re-suspend pellet in 40(l sample buffer, vortex and heat at 65( for 5 min
Vortex again until pellet is gone (pipetting can help too)
Heat 5 min at 65( again
For low cell number
Resuspend in 20(l of Laemlli buffer containing freshly added 100mM DTT
Heat 5 mins at 95癈
Spin the sample for 30s at top speed and transfer supernatant to new tube, store -20(
Quantification and loading:
Measure concentration by OD280. Use buffer including DTT as a reference since DTT absorbs at this wavelength
Add 10x Orange G to each sample to 1x final concentration before loading
For samples in Sample buffer:
Heat 10min at 65(, spin briefly and load on gel
(Don抰 place samples on ice as they will solidify!)
For samples in Laemlli buffer:
Heat 5min at 95(, spin briefly and load on gel
Sample buffer: 10ml�:
70mM Tris pH6.8 700祃 of 1M
8M urea 4.8g
5% SDS 2.5ml 20% (the good stuff from Biorad)
1mM EDTA 20祃 of 0.5M
water to 9ml, warm gently to dissolve
100mM DTT Add from 1M stock just before use
Laemlli buffer: 60mM Tris pH 6.8
10% Glycerol
2% SDS (from the high quality 20% stock)
Make this to 90% final volume, then just before use add
10% 1M DTT (giving final concentration of 100mM DTT)
10x Orange G: 0.1% Orange G in water
7.4% �-mercaptoethanol can be used, but the process needs to be performed in the fume hood
don t heat samples above 70( in this buffer as the proteins will aggregate
Diluting and measuring by Bradford assay is probably more accurate
FILENAME 45acmuv������h i j l � � �
&
'
6
7
B
E
F
L
M
]
e
f
g
�
�
�
�
�
�
蜾嘬哲嘌腿睦募芳超敞牗湪湪监茑监曕晳崏�戃戃鄷嘬鄳jh襩�0JUh猆oh�>ThT[t jm�h鞾�h��hV
hV
>*hV
hV
hV
hii� h�'{H*h�'{h=�hKrj h�0H*h�0h齦� j梆h�>-h�>-h鞾�h鞾�h�{5丆J(\乤J(h鞾�h鞾�5丆J(\乤J(2bc���j k
/
0
z
{
�
�
�
�
�
;<jk��������������������������gd鞾�gdV
勑^勑gdii�gd�'{gdKrj$a$gd鞾��
�
�
�
�
�
*3<Ijk������������������:;BCDVWYgh������������
耥耥殄磲眈眈蓠僬碚硌袷祈倏俚倏俦侏辟保睙贌俦俦棻頁褜� j梆hV!�hii�h/�OJQJh谼� jm�h/�h��h/�h/�jh��0JU j梆h��h�!= jm�h鞾�hV!�he�h��h�>Th�([h襩�h=�h�>-h鞾�hT[t j梆hT[t7����*BCX���
)
*
�
�
�
�
3gh����������������������������gdV
gd/�gdii�勑`勑gd��gd��gd鞾�
)
H
I
�
�
�
�
�
�
123fgh����������/0��������F疰疴疴疝怵尊掴摒逾题募宝紴棑彄鹩饒~zrz驸题h襩�OJQJh襩�jh襩�0JUhVEhV!�he�hii�hVEhii�hii�mHsHhe�he�mHsHhe�h�!=mHsHh�>-mHsHh��mHsH j梆h��hV
j梆hV!�h/�h��jh��0JUhV!�hV!�hV!�6�ha�,�����0Jv����O������F�������������������������������gd��gd鞾�劆勑^劆`勑gdii�gdV
FH�����������$$$$$'$+$,$-$.$/$5$6$7$8$9$:$;$<$躐礤礤礤礤磔僮菸蓠偈倨偌都倨頄hVEhV!�jh�P0JU�*h谼�0JmHnHu�*
h�P0Jjh�P0JUhdB�h�"�hZGLmHnHuUh�Pjh�PUjhIJ�UhIJ�h��jh��0JU ������,$-$9$:$;$<$�����������gd鞾�Yeast Protein Isolation v1.7 Houseley lab
PAGE 2
,1恏皞. 捌A!�"�#悹$悹%�澳澳惸�s2���� 0@P`p€�����2(�� 0@P`p€����� 0@P`p€����� 0@P`p€����� 0@P`p€����� 0@P`p€����� 0@P`p€�8X�V~�����€�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@_HmH nH sH tH @`�@NormalCJ_HaJmH sH tH DA`��DDefault Paragraph FontRi��RTable Normal�4�
l4�a�(k ��(No List4@�4�PHeader
�9r 4 @4�PFooter
�9r .)@�.�PPage Number>@">ii�
Footnote TextCJaJ<���1<�ii�Footnote Text Char@&`�A@ii�Footnote ReferenceH*PK!檗�[Content_Types].xml瑧薔�0E鱄鼉�-J湶@%閭菐洽|廊�$韶钵UL襎B� l,�3鳛;鉹�得槣B+$�G]ミ7O侪V墎�c:菜�E3v@釶莮�憇� |煓w�<�<爔k猴ll5�
玈Z埣2O,辜帣Q績� €‰壪�5y�;y=卐E颎翼帊|\P疼 鞭M7�$|n]�枌蓢]4忥`窾6涀G冼(垲�^斗菹颻琖��-翻関]m蓿瓄� 飍祡缧暺}攙旯缦r�鍧竔倲崜0�� D3劂梋閐�3譙钐嚟�耳杧:忲�8}d-楀鉯*壵x上轻qCよZ}�柣WlшqyI@赹剟6橧!Q_� ﹪s殔刏賩a汛癶H魉Tm�jyV`垆纅�榾惫�<箣犇鼁YpL8�*аx侏S&机;EUC�8⒊eE�<В悟hg贇!燴H睩x0�
VM螽憆刳u�6拺覦s�3
U慮赢b��6�怂5y嵳2臓iz嘜]r汯璠�'鋆炃弦u涎4jj採�K臀F娃盶�晕�$4寨-莓�-�珠`餜�熘��&藑代觥瀈A<吼"xNW﹦� �
袬鞩R賭[鋺萵
8r� i箯K~�*~P(5黕莲z胦Wm忒杮~乖鞹濦caT鲇�.}x
E僮5抉&Z緄�2bQ懇/,EE\}�)W�乹埼鉠ミ�6;礏弛�糿h礜贻~7�威�9R`痌
糧疩〞儬嗾J拁▄旿郢�=$燮朗Sb酻紇���PK!
褠煻'theme/theme/_rels/themeManager.xml.rels剰M
�0匃倃oo雍�&輬协�勪5
6?$Q祉
�,.嘺緳i粭澤c2�1h�:闀q毩m胳嶡RN壻;d癭値o7�g慘(M&$R(.1榬'J摐袏T鶂�8V�"&A然蠬鱱}狇�|�$絙{�朠�除8塯/]As賲(⑵锑#洩L蔥汉倪��PK-!檗�[Content_Types].xmlPK-!ブх�60_rels/.relsPK-!ky���theme/theme/themeManager.xmlPK-!稝��theme/theme/theme1.xmlPK-!
褠煻'� theme/theme/_rels/themeManager.xml.relsPK]�
L�HJ
]���J
-&���� DDQQQT�
F<$
���<$
/ELNT�晙!�晙�8�@����€€€�饞��0�( �
�養
�S���� ?�<@Xanu����w~����(.�� � � � � � �
H
K
i������HIOO�����1fg������� � � � � �
9
;
<
F
K
i������HIOO�����1fg�������K
3�2�-UV
p#}sVE�>-�0�!=�@�/GgJ蘿JZGL�PjS�>T�([�gKrj猆oT[t�{�'{S~e�蚙�!o�/�鞾�卂�谼�朜�[�7�t� �dB�齦�K�V!�ii�=�a�襩���8�}>�5�IJ��"� �@€����(
J
h@hhH@��Unknown������������G��*郈x� �Times New Roman5�€Symbol3.��*郈x� �ArialC.,�爗 @�Calibri Light7.����@�CalibriA���$B�Cambria Math"1�鹦hL��eGR|鼏KX�X�q����亖4 2�� ��HP �?���������������������� �2!xx�蝹d^���Yeast Protein IsolationHouseleyJon Houseley�鄥燆鵒h珣+'迟0��������
8DP
\hpx€�Yeast Protein IsolationHouseleyNormalJon Houseley11Microsoft Office Word@�5z
@敾~M惶@淂滴@毪=嵊X��胀諟.摋+,0hp��������
���Edinburgh Univeristy Yeast Protein IsolationTitle
��� !"#$���&'()*+,���./01234������78������;�����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������Root Entry�������� �F ⒉=嵊:@1Table������������l WordDocument ��������.&SummaryInformation(����%DocumentSummaryInformation8������������-MsoDataStore��������@�=嵊0驓�=嵊S������R��0�RU��YI�0��==2��������@�=嵊0驓�=嵊Item
��������2Properties������������UCompObj����r���������������������������
����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
�
���� �F Microsoft Word 97-2003 Document
MSWordDocWord.Document.8�9瞦